NRPB57L Ni-NTA琼脂糖凝胶FF

相关介绍： 

Ni-NTA琼脂糖凝胶FF以琼脂糖微球為(wèi)基质，通过活化偶联次氮基三乙酸（NTA），再螯合Ni²⁺。与亚氨基二乙酸（IDA）相比，具有(yǒu)更好的螯合剂、还原剂、碱性的耐受性，如样品中含有(yǒu)1-10mM EDTA或1-10mM β-巯基乙醇或5mM DTT，可(kě)正常纯化；在螯合镍的情况下，也可(kě)以用(yòng)0.1M NaOH清洗。

Ni-NTA琼脂糖凝胶FF主要用(yòng)于纯化带组氨酸标签（His-Tag）的重组蛋白。纯化原理(lǐ)是利用(yòng)重组蛋白组氨酸标签的咪唑环可(kě)与过渡金属Ni²⁺形成稳定的配位键，因此能(néng)特异、牢固、可(kě)逆地吸附于固定这些金属离子的基质，结合了His-Tag重组蛋白的Ni-NTA琼脂糖凝胶FF一般通过增加咪唑浓度进行竞争洗脱。

技术指标：

使用(yòng)方法：

1、色谱柱装填

以下阐述与层析系统连接时，填料的色谱柱装填方法。

1.1所有(yǒu)需要用(yòng)到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液體(tǐ)最好做脱气处理(lǐ)。

1.2填料用(yòng)量计算：通过沉降定量填料體(tǐ)积，需要的沉降填料體(tǐ)积=柱體(tǐ)积×压缩比（也称压缩因子）。沉降體(tǐ)积是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完全读取的稳定體(tǐ)积。IDA NUPharose FF的压缩比為(wèi)1.15。為(wèi)使达到装柱比，可(kě)通过柱头下压的方法，也可(kě)以通过高流速压柱。

1.3填料清洗：将填料悬液充分(fēn)摇匀后量取相应體(tǐ)积，抽滤除去液體(tǐ)，并用(yòng)约3倍填料體(tǐ)积的纯化水洗涤，重复3次，以除去保存液。

1.4装柱填料悬液准备：将填料转移到适当的容器中，加入适量的装柱液，制成50~75 v%的装柱填料悬液，使用(yòng)前搅匀。

1.5装填前准备：在清洗干净的层析柱下端加入装柱液，以除去下垫片及层析柱下端的空气，在柱内保留少量的蒸馏水，拧紧下堵头，调整柱子使其垂直于地面。

1.6装填：将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内（必要时使用(yòng)装柱器），為(wèi)避免引入气泡，应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有(yǒu)填料加入后，用(yòng)装柱液将装柱器加满，拧紧装柱器上盖，将柱子与层析系统连接。

1.7压柱：使柱内填料自然沉降（或50~150 cm/h的低流速下沉降），待填料沉降完全后（填料与液體(tǐ)的界面清晰），去除装柱器，装上上柱头，并将柱头下降至界面处；通过高流速（推荐流速见下表，注意柱压不超过0.3 MPa），继续压柱至界面清晰稳定，标记界面稳定时的柱高。停泵，打开柱头上的阀门/堵头，关闭柱底的阀门/堵头，下压柱头至标记位置下方与压缩比对应的位置，旋紧柱头，装柱完成。装柱完成后，需用(yòng)高流速平衡柱内的填料。

2、上样

（1）缓冲液选择：一般选用(yòng)pH6-8的结合缓冲液，常用(yòng)缓冲液有(yǒu)10-00mM 磷酸钠缓冲液、20-200mM Tris-HCl缓冲液等。在缓冲液中一般要加入0.15-0.5M的NaCl，以消除离子交换作用(yòng)。在初次使用(yòng)Ni-NTA琼脂糖凝胶FF，推荐使用(yòng)50mM PBS（50 mM NaH₂PO₄，0.5M NaCl，NaOH调节pH 7.4）作為(wèi)结合缓冲液。

（2）样品处理(lǐ)：样品的缓冲液应与所选结合缓冲液一致。為(wèi)保证缓冲液一致，可(kě)以在结合缓冲液中破碎细菌、或调解pH与结合缓冲液一致、或交换至结合缓冲液（常用(yòng)方法有(yǒu)透析、超滤、脱盐柱换液等）、或用(yòng)结合缓冲液稀释2-10倍等。样品上柱前应0.45μm过滤。

3、洗脱

（1）Ni-NTA琼脂糖凝胶FF最常用(yòng)的洗脱方法為(wèi)增加咪唑浓度进行洗脱。

（2）咪唑為(wèi)碱性，相应缓冲液配制后需要用(yòng)HCl进行调节pH。

（3）在初次使用(yòng)Ni-NTA琼脂糖凝胶FF，不知道洗脱的咪唑浓度，建议在结合缓冲液中分(fēn)别加入10mM、20mM、50mM、100mM、200mM、500mM咪唑，浓度从低到高，分(fēn)别洗脱和收集，通过SDS-PAGE電(diàn)泳等方法鉴定洗脱组份。

（4）有(yǒu)条件的也可(kě)以进行線(xiàn)性咪唑梯度洗脱，确定较佳洗脱条件。

4、在位清洗

在多(duō)次使用(yòng)后需要在位清洗，常用(yòng)方法為(wèi)先5个柱體(tǐ)积蒸馏水清洗，再用(yòng)1-3个柱體(tǐ)积50mM NaOH清洗10-20min，立即用(yòng)5个柱體(tǐ)积结合缓冲液（50mM PBS）清洗平衡。

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