制药工具|内毒素来源及检测方法

一、内毒素简介

大肠杆菌是生物(wù)领域最常用(yòng)的工程菌之一，具有(yǒu)生長(cháng)速度快、培养成本低、基因克隆表达系统成熟完善等优势，其质粒常被用(yòng)作基因工程中的载體(tǐ)，在基因的分(fēn)子克隆、疫苗研发、重组蛋白类药物(wù)的表达和生产等领域已有(yǒu)广泛的应用(yòng)，但同时需要严格控制相关生物(wù)制品中内毒素的残留水平。

内毒素位于革兰氏阴性菌细胞壁的最外层，覆盖于细胞壁的黏肽上，化學(xué)成分(fēn)是磷脂-多(duō)糖-蛋白质复合物(wù)，主要毒性成分(fēn)是脂多(duō)糖（LPS）中的类脂A（图1），只有(yǒu)当菌體(tǐ)死亡溶解或者用(yòng)人工方法破坏菌體(tǐ)细胞后内毒素才释放出来。内毒素能(néng)够直接作用(yòng)于人體(tǐ)，通过与宿主细胞上的Toll样受體(tǐ)（TLR）结合激活组织内的炎性细胞及炎症因子，导致机體(tǐ)发热并产生全身炎症性反应，继而引起弥散性血管内凝血、休克、多(duō)脏器功能(néng)衰竭等严重的病理(lǐ)生理(lǐ)症状，又(yòu)称之為(wèi)“热原”。内毒素具有(yǒu)极强的生物(wù)活性，即使是微量内毒素也会引起机體(tǐ)的各种炎症反应和免疫应答(dá)。内毒素具有(yǒu)较好的耐热性和稳定性，在60℃的温度下加热数小(xiǎo)时也不会被破坏，完全灭活需在180℃高温下加热3小(xiǎo)时以上，一般的化學(xué)药品也不会影响细菌内毒素的活性，只有(yǒu)强酸、强碱或强氧化剂可(kě)以破坏其结构。

二、内毒素的检测方法

内毒素可(kě)以与特定的检测试剂发生反应，基于这一原理(lǐ)开发出内毒素的检测方法。常见的检测方法包括凝胶法、重组C因子法、动态比浊法等。

鲎试剂中的C因子是对内毒素敏感的蛋白，能(néng)够与内毒素结合并被激活，从而启动整个鲎试剂血凝级联反应（图2），凝胶法根据该原理(lǐ)来检测内毒素，并通过观察有(yǒu)无凝集素形成作為(wèi)反应的终点。该方法简便易操作且不需要使用(yòng)光學(xué)检测仪，但检测范围存在一定的局限性。

鲎试剂的制备需要捕捉大量的鲎并抽取其血液（图3），随着对鲎的保护以及重组技术的发展，新(xīn)一代人工合成的重组C因子开始被用(yòng)于内毒素的检测中。重组C因子被内毒素活化后能(néng)够与荧光底物(wù)作用(yòng)产生荧光信号，荧光信号强度与内毒素浓度成正比关系，可(kě)据此来测定内毒素含量。该检测方法不存在G因子旁路干扰，具有(yǒu)较高的特异性，可(kě)用(yòng)于含有(yǒu)β-葡萄糖干扰的样品检测。

动态比浊法可(kě)通过光學(xué)测定仪测定反应混合物(wù)达到预定OD值所需时间和浊度变化的速率，检测数据不仅有(yǒu)利于追踪产品质量，还能(néng)起到风险预警作用(yòng)。

三、内毒素的去除方法

由于内毒素具有(yǒu)显著的危害性，FDA等法规也对内毒素控制提出明确要求。首先要从源头消除外源性内毒素污染，在生物(wù)药物(wù)研发及生产过程中，要确保与样品直接接触的设备、容器、储液袋、原辅料、耗材等经过严格消毒灭菌处理(lǐ)。其次对于样品本身就存在的内源性内毒素污染，需要从样品本身制备工艺角度出发，寻找合适方法，如离子交换层析法、疏水层析法、特异性吸附等。

离子交换层析法：根据目标产物(wù)与内毒素在缓冲液中的带電(diàn)性质差异，可(kě)以利用(yòng)离子交换层析的方法去除内毒素。阴离子交换层析主要通过改变缓冲液的离子强度使内毒素分(fēn)子带大量负電(diàn)荷，能(néng)够与带正電(diàn)荷的配基结合，从而将其去除；阳离子交换层析主要采用(yòng)吸附模式，通过改变缓冲液的pH使带正電(diàn)荷的目的蛋白吸附在离子交换介质上，带负電(diàn)荷的内毒素流穿，实现分(fēn)离。

疏水层析法：内毒素在高盐条件下会聚集成大多(duō)数不与疏水填料结合的复合物(wù)，上样时直接穿透而被去除。或者采取目标样品流穿模式，在一定盐浓度下使目的蛋白不与填料结合而内毒素分(fēn)子可(kě)与其结合，从而实现分(fēn)离。

特异性吸附：将多(duō)粘菌素B偶联于层析介质上，通过介质特异性吸附内毒素，蛋白因不会被该层析介质吸附而随流动相流出，收集该流出蛋白即可(kě)。该方法去除内毒素效果较好, 但有(yǒu)一定的蛋白损失。

此外，还可(kě)以依据内毒素在不同的水溶液中形成的聚集體(tǐ)分(fēn)子量大小(xiǎo)差异，通过凝胶过滤层析和切向流膜过滤技术等方法将其去除。

四、关于纽龙

大肠杆菌因培养成本低且基因克隆表达系统成熟完善等优势成為(wèi)蛋白表达系统中常用(yòng)的工程菌，但其自身存在的内源性内毒素残留是不可(kě)避免的问题。在产品开发过程中，内毒素的残留控制和检测是重要的环节之一。

纽龙生物(wù)科(kē)技有(yǒu)限公司是一家专注于重组蛋白以及蛋白纯化填料研发生产的國(guó)家高新(xīn)技术企业，致力于提供最专业的制药工具与服務(wù)，产品自立项开发之初便重点关注内毒素的残留控制及检测。近日，依据《全國(guó)城市工业品贸易中心联合会团體(tǐ)标准管理(lǐ)办法》有(yǒu)关规定，纽龙生物(wù)全资子公司纽龙合成材料制造有(yǒu)限公司作為(wèi)牵头单位，积极参与推动《生物(wù)分(fēn)离介质内毒素检测方法》团體(tǐ)标准的制定工作。

参考文(wén)献：

[1] Chen R H, Huang C J, Newton B S, et al. Factors affecting endotoxin removal from recombinant therapeutic proteins by anion exchange chromatography[J]. Protein Expression & Purification, 2009, 64(1):76-81.

[2] 徐向荣,马國(guó)昌,王昌梅,等.层析法去除重组人血清白蛋白干扰素α2b融合蛋白的内毒素[J]. 生物(wù)工程學(xué)报, 2008(01): 159-163.

[3] Rita F Maldonado, et al., Lipopolysaccharide modification in Gram-negative bacteria during chronic infection. FEMS Microbiol Rev. 2016 Jul;40(4):480-93.doi: 10.1093/femsre/fuw007.