Strep-tag纯化系统进化史

高效的纯化、检测、固定化或分(fēn)离在现代蛋白研究领域至关重要，特别是在结构基因组學(xué)和蛋白组學(xué)领域。使用(yòng)经济、简单且可(kě)靠的方法快速分(fēn)离重组蛋白（特别是在高通量筛选的实验条件下），有(yǒu)助于快速对其生物(wù)活性进行表征，识别其相互作用(yòng)的物(wù)质。Strep-tag Ⅱ作為(wèi)一种用(yòng)于亲和纯化的短肽标签，与重组蛋白进行融合表达后，可(kě)以进一步用(yòng)于分(fēn)离纯化。

一、Strep-tag发展史

Strep-tag 是从随机文(wén)库中筛选得到的9个氨基酸的短肽( AWRHPQFGG) ，可(kě)与链霉亲和素（SA）进行可(kě)逆结合。当用(yòng)作标签时，可(kě)以与重组蛋白实现融合表达，进而通过SA亲和层析柱一步纯化重组蛋白。Strep-tag 短肽骨架表现為(wèi)螺旋构象( HPQFG) ，其中8个氨基酸残基( WRHPQFGG) 参与亲和作用(yòng)，C-末端甘氨酸的游离羧基可(kě)与链霉亲和素R84形成盐桥，因而Strep-tag与蛋白融合表达时被限制在C端。由于SA与Strep-tag的结合位点同其与生物(wù)素的结合位点基本一致，故而Strep-tag可(kě)以与生物(wù)素竞争性的结合SA。

通过将 Strep-tag与目的蛋白融合表达，利用(yòng)填料吸附带有(yǒu)Strep-tag的重组蛋白，再利用(yòng)生物(wù)素竞争洗脱，获得目的蛋白。但由于Strep-tag 仅可(kě)结合在目的蛋白的C端，且其对链霉亲和素的亲和力较弱，因此未得到广泛的应用(yòng)。

在对Strep-tag的氨基酸序列进行优化和修改后，科(kē)研工作者开发了更合适的短肽标签Strep-tag Ⅱ (WSHPQFEK)。Strep-tag Ⅱ是一个由8个氨基酸组成的短肽，其序列為(wèi)Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys，不仅可(kě)以结合在蛋白的C端，也可(kě)以结合在蛋白的N端。此外，Strep-tag Ⅱ对蛋白的折叠或生物(wù)活性不产生影响，也不会诱导蛋白聚集，因此后续实验一般无需去除。

在随后的研究工作中，科(kē)研工作者发现如果目标蛋白表达量很(hěn)低，Strep-tag Ⅱ纯化系统不能(néng)快速对蛋白进行纯化，于是对其进一步进行了改造，用(yòng)linker将两个Strep-tag Ⅱ连接在一起，开发出Twin-Strep-tag（也有(yǒu)叫双Strep-tag Ⅱ）。Twin-Strep-tag具有(yǒu)特异性高、一步纯化纯度高、纯化过程条件温和、蛋白两端均可(kě)融合等特点，改善了低浓度样本纯化效果，还能(néng)用(yòng)于捕捉蛋白复合體(tǐ)、检测蛋白间的相互作用(yòng)。

二、 基于Strep-tag的SA改造

最初Strep-tag被开发出来时，其与SA的亲和力相较于生物(wù)素较弱，较弱的亲和力虽可(kě)在相对温和的条件下进行竞争性洗脱，但也限制了其对标签蛋白的捕获，且在较弱的相互作用(yòng)下，不能(néng)保证Strep-tag可(kě)以与配基充分(fēn)结合。因此，需要对SA进行进一步改造，以满足Strept-tag纯化系统的需要。

Strep-Tactin是对SA的氨基酸序列进行重构和改造而来的，通过对靠近结合位点的一个环區(qū)中的多(duō)个氨基酸进行突变，从而获得有(yǒu)活性且与Strep-tag Ⅱ亲和能(néng)力增强的SA突变體(tǐ)，即Strep-Tactin。相较于SA，Strep-Tactin 与 Strep-tag Ⅱ 的结合更加紧密，能(néng)够在温和的条件下与Strep-tag Ⅱ融合蛋白进行结合和解离。而且由于Strep-Tacin对Strep-tag Ⅱ具有(yǒu)高度特异性，一般一步纯化就能(néng)获得高纯度的蛋白样品（图1），被广泛应用(yòng)于蛋白纯化或检测中，以及某些细胞分(fēn)离检测领域。一般选用(yòng)脱硫生物(wù)素进行竞争性洗脱即可(kě)，利用(yòng)2-（4-羟基苯唑）苯甲酸（HABA）溶液可(kě)实现Strep -Tactin填料的再生。

但是，Strep-Tactin也有(yǒu)一定的局限之处，比如，在变性条件下并不稳定，无法进行纯化，且进行批量纯化时，即使搭配Twin-Strep-tag，效果仍不尽人意。因此对Strep-Tactin进行进一步改造后，得到与Twin-Strep-tag亲和力更高的Strep-tactin2。同时，因亲和力增加，即使经过多(duō)次清洗步骤，目的蛋白也不会从Strep-Tactin2上解离，从而提高了目标蛋白的得率。2018年，中南大學(xué)湘雅二医院的科(kē)研工作者通过将 Strep-tag Ⅱ融合在目标蛋白的C端，利用(yòng)这一亲和纯化系统，首次从哺乳动物(wù)细胞中分(fēn)离纯化得到了TMEM8B-a蛋白，并验证该蛋白在抑制肿瘤细胞侵袭转移中发挥重要作用(yòng)。

  TMEM8B-a蛋白的三级结构图

    Strep-tag系统的发展过程由Strep-tag到Strep-tag Ⅱ再到Twin-Strep-Tag，其与SA的亲和力和特异性逐渐增强，与之相关的亲和纯化填料由Strep-Tactin 到改造后的Strep-Tactin 2 ，其与Strep-tag系列短肽标签的亲和力也逐渐增强。

       纽龙生物(wù)通过自有(yǒu)的蛋白定向进化及发酵生产平台，对SA进行了一系列改造及优化，具有(yǒu)多(duō)达数十种SA突变體(tǐ)的蛋白文(wén)库。基于自有(yǒu)填料研发平台，利用(yòng)重组Strep-Tactin 2开发出用(yòng)于Strep-tag纯化系统的亲和纯化填料。

Strep-Tactin 2 NUPharose FF（NRPB61L）在用(yòng)于纯化带Strep-tag Ⅱ 和Twin-Strep-tag 的重组蛋白时，具有(yǒu)如下优势：

高选择性：Strep-Tactin 2 对标签的选择性大大提高，无论是Strep-tag Ⅱ 还是Twin-Strep-tag，都能(néng)够实现较好的纯化效果，一般只需一步纯化就能(néng)获得高纯度的蛋白质样品。

高结合载量：通过对配基设计进行改进，进一步提高了对标签的亲和力，并且削弱了与生物(wù)素的亲和力，从而能(néng)够更牢固的结合重组蛋白，动态结合载量可(kě)以达到10 mg/mL。

高耐受性：通过对配基、偶联、填料的优化改造，提升了对某些蛋白变性剂、表面活性剂的耐受性。

经济性：在洗脱方面，可(kě)以使用(yòng)生物(wù)素进行洗脱，相对昂贵的脱硫生物(wù)素更经济。

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