制药工具|疏水填料介绍

一、原理(lǐ)

疏水层析是一种根据分(fēn)子表面疏水性不同来分(fēn)离纯化生物(wù)大分(fēn)子的方法，具有(yǒu)“高盐上样、低盐洗脱”的特点，疏水填料的疏水配基和蛋白质分(fēn)子疏水性基团的表面都有(yǒu)一层水分(fēn)子有(yǒu)序排列的水化膜，当溶液处于高盐浓度时，水化膜被破坏，蛋白质疏水基团暴露增多(duō)，疏水填料的疏水配基与蛋白质分(fēn)子之间的疏水作用(yòng)增加，从而结合目标蛋白。降低盐浓度后，疏水填料的疏水配基和蛋白质分(fēn)子表面的逐步形成水化膜，两者之间的疏水作用(yòng)减弱，从而洗脱蛋白。

二、填料的选择

由于各种生物(wù)大分(fēn)子的疏水性和疏水基团存在不同，与不同疏水配基、不同疏水配基密度的填料之间的相互作用(yòng)也不同，选择合适的层析条件可(kě)以将不同的分(fēn)子分(fēn)离。

1、配基的选择：配基的选择取决于目标蛋白的特性，包括其分(fēn)子量、等電(diàn)点、极性等。在选择配基时，一般考虑碳链長(cháng)度、极性、空间结构等因素。常用(yòng)的配基包括丁基、苯基、辛基等，这些基团在碳链長(cháng)度和极性方面存在差异，苯环数量越多(duō)或碳链越長(cháng)，填料的疏水性越强。丁基具有(yǒu)较低的表面能(néng)，适用(yòng)于分(fēn)离低极性和非极性蛋白；辛基具有(yǒu)较高的表面能(néng)，适用(yòng)于分(fēn)离高极性和亲水性蛋白。

2、疏水填料类型的选择：常用(yòng)的疏水填料有(yǒu)不同的基球材质、交联方式、粒径、孔径等，使用(yòng)时可(kě)根据实际情况进行选择。通常情况下，工业纯化捕获阶段推荐选择高流速、高刚性、大孔径的琼脂糖微球，到了精纯阶段，可(kě)考虑选择粒径更小(xiǎo)的微球以提高分(fēn)辨率。

三、使用(yòng)过程

  疏水填料的使用(yòng)过程主要包括以下步骤：

1、平衡与上样：磷酸盐-硫酸铵溶液是最常用(yòng)的疏水层析盐溶液體(tǐ)系，也可(kě)以根据盐析原理(lǐ)选择其他(tā)盐，一般采取“高盐上样、低盐洗脱”的模式。

2、洗脱：可(kě)用(yòng)恒定洗脱、梯度洗脱或者阶跃洗脱，一般推荐降低盐浓度的梯度洗脱进行。亦可(kě)根据实际情况，添加有(yǒu)机溶剂进行洗脱。

3、再生：用(yòng)蒸馏水按操作流速冲洗，接着用(yòng)平衡液冲洗。若有(yǒu)失活蛋白质或脂类物(wù)质在再生时洗不掉，可(kě)用(yòng)在位清洗除去。

4、在位清洗：可(kě)有(yǒu)效去除介质上的杂质，反向效果更佳。

四、优点

1、活性回收率高。用(yòng)中性或接近中性的盐水缓冲液作為(wèi)流动相，使得在酸性及有(yǒu)机溶剂条件下容易失活的蛋白质，能(néng)以活性状态在疏水填料上进行分(fēn)离。

2、采用(yòng)含盐缓冲液作為(wèi)流动相，可(kě)以在相似条件下进行许多(duō)需要保持生物(wù)活性的蛋白质的理(lǐ)化性质研究。

3、流动相成本低，大大减少了反相层析中使用(yòng)的有(yǒu)机溶剂对环境的污染。

五、注意事项

1、不同配基的疏水填料与蛋白的结合能(néng)力不同，在进行疏水层析时要对不同的疏水填料进行筛选对比。

2、同一配基的疏水填料由于配基密度不同，其和蛋白的的疏水作用(yòng)力也不同，选择填料时也要对不同配基密度的疏水填料进行筛选对比。

3、蛋白在高盐浓度下可(kě)能(néng)发生沉淀，在选择盐溶液之前，应先评估蛋白质复合物(wù)在溶液中的溶解性。

4、蛋白随温度的增加，其疏水基团充分(fēn)暴露，和疏水介质的作用(yòng)力变大，疏水层析过程要注意温度的影响。