NRPB07L Ni-IDA琼脂糖凝胶FF

相关介绍： 

镍-琼脂糖凝胶FF以琼脂糖微球為(wèi)基质，通过活化偶联亚氨基二乙酸（IDA），再螯合Ni²⁺。其中IDA是金属螯合层析中最常用(yòng)的配體(tǐ)，与次氮基三乙酸（NTA）相比，具有(yǒu)亲和力强，载量高，可(kě)再生重复使用(yòng)的特点。

镍-琼脂糖凝胶FF主要用(yòng)于纯化带组氨酸标签（His-Tag）的重组蛋白。纯化原理(lǐ)是利用(yòng)重组蛋白组氨酸标签的咪唑环可(kě)与过渡金属Ni²⁺形成稳定的配位键，因此能(néng)特异、牢固、可(kě)逆地吸附于固定这些金属离子的基质，结合了His-Tag重组蛋白的镍-琼脂糖凝胶FF一般通过增加咪唑浓度进行竞争洗脱。

技术指标：

使用(yòng)方法：

1.色谱柱装填

以下阐述与层析系统连接时，填料的色谱柱装填方法。

1.1所有(yǒu)需要用(yòng)到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液體(tǐ)最好做脱气处理(lǐ)。

1.2填料用(yòng)量计算：通过沉降定量填料體(tǐ)积，需要的沉降填料體(tǐ)积=柱體(tǐ)积×压缩比（也称压缩因子）。沉降體(tǐ)积是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完全读取的稳定體(tǐ)积。IDA NUPharose FF的压缩比為(wèi)1.15。為(wèi)使达到装柱比，可(kě)通过柱头下压的方法，也可(kě)以通过高流速压柱。

1.3填料清洗：将填料悬液充分(fēn)摇匀后量取相应體(tǐ)积，抽滤除去液體(tǐ)，并用(yòng)约3倍填料體(tǐ)积的纯化水洗涤，重复3次，以除去保存液。

1.4装柱填料悬液准备：将填料转移到适当的容器中，加入适量的装柱液，制成50~75 v%的装柱填料悬液，使用(yòng)前搅匀。

1.5装填前准备：在清洗干净的层析柱下端加入装柱液，以除去下垫片及层析柱下端的空气，在柱内保留少量的蒸馏水，拧紧下堵头，调整柱子使其垂直于地面。

1.6装填：将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内（必要时使用(yòng)装柱器），為(wèi)避免引入气泡，应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有(yǒu)填料加入后，用(yòng)装柱液将装柱器加满，拧紧装柱器上盖，将柱子与层析系统连接。

1.7压柱：使柱内填料自然沉降（或50~150 cm/h的低流速下沉降），待填料沉降完全后（填料与液體(tǐ)的界面清晰），去除装柱器，装上上柱头，并将柱头下降至界面处；通过高流速（推荐流速见下表，注意柱压不超过0.3 MPa），继续压柱至界面清晰稳定，标记界面稳定时的柱高。停泵，打开柱头上的阀门/堵头，关闭柱底的阀门/堵头，下压柱头至标记位置下方与压缩比对应的位置，旋紧柱头，装柱完成。装柱完成后，需用(yòng)高流速平衡柱内的填料。

2.上样

2.1 样品一般溶解在pH6 ~ 8的初始缓冲液中，提高上样缓冲液的pH值，可(kě)以增大载量。

2.2 缓冲液中不能(néng)含有(yǒu)EDTA和柠檬酸盐，也最好不含巯基乙醇、DTT等还原剂。

2.3常用(yòng)缓冲液有(yǒu)10 ~ 100 mM 磷酸钠缓冲液、20 ~ 200 mM Tris-HCl缓冲液等。

2.4在缓冲液中一般要加入0.15 ~ 0.5 M的NaCl，以消除离子交换作用(yòng)。

2.5在初次使用(yòng)镍-琼脂糖凝胶FF，推荐使用(yòng)50 mM PBS（50 mM NaH₂PO₄，0.5 M NaCl，NaOH调节pH 7.4）作為(wèi)初始缓冲液。

3. 洗脱

3.1 镍-琼脂糖凝胶FF最常用(yòng)的洗脱方法為(wèi)增加咪唑浓度进行洗脱。

3.2咪唑為(wèi)碱性，相应缓冲液配制后需要用(yòng)HCl进行调节pH。

3.3在初次使用(yòng)镍-琼脂糖凝胶FF，不知道洗脱的咪唑浓度，推荐在初始缓冲液中分(fēn)别加入10 mM、20 mM、50 mM、100 mM、200 mM、500 mM咪唑，浓度从低到高，分(fēn)别洗脱和收集，通过SDS-PAGE電(diàn)泳等方法鉴定。

3.4 有(yǒu)条件的也可(kě)以进行線(xiàn)性咪唑梯度洗脱，确定较佳洗脱条件。

拓展应用(yòng)：

1. 更换不同的螯合离子

1.1 IDA螯合的镍-琼脂糖凝胶FF可(kě)以用(yòng)EDTA脱掉镍，脱掉镍后可(kě)以用(yòng)0.1 ~ 1.0M NaOH进行清洗凝胶，再重新(xīn)螯合镍，使凝胶焕然一新(xīn)。也可(kě)以螯合其他(tā)金属离子，如Cu²⁺，Zn²⁺，Co²⁺，Fe³⁺等，进行多(duō)样纯化。

1.2 脱镍方法：用(yòng)5 ~ 10个柱體(tǐ)积蒸馏水淋洗柱子，再用(yòng)5 ~ 10个柱體(tǐ)积的100 mM EDTA淋洗柱子，再用(yòng)2 ~ 3个柱體(tǐ)积的0.5 M NaCl洗掉残留的EDTA。

1.3螯合金属离子方法：用(yòng)2 ~ 5个柱體(tǐ)积的蒸馏水充分(fēn)平衡脱镍的柱子，用(yòng)0.1 ~ 0.3M金属盐溶液过柱5 ~ 10个柱體(tǐ)积螯合金属，螯合后用(yòng)5 ~ 10个柱體(tǐ)积蒸馏水淋洗，去除未螯合的金属离子。

1.4 金属盐可(kě)以為(wèi)硫酸盐或盐酸盐，如為(wèi)NiSO₄、CuSO₄、ZnSO₄、CoCl₂、PbSO₄等，金属盐溶液应中性或弱酸性，且必须经过过滤，以防止金属盐在胶上沉淀。

1.5 如果是Fe³⁺必须在低pH下螯合（pH 3），以防止Fe³⁺产生沉淀，一般可(kě)以加入少量盐酸和硫酸保持pH。

2. 多(duō)种洗脱方法

2.1 降低pH洗脱：大多(duō)数蛋白在pH 4 ~ 6会被洗脱下来，也可(kě)以在pH 3 ~ 4，缓冲液可(kě)以是醋酸钠、柠檬酸或磷酸盐缓冲體(tǐ)系。

2.2 竞争性洗脱：線(xiàn)性增加或一步增加与金属离子有(yǒu)亲和力的物(wù)质，如0 ~ 0.5 M咪唑，0 ~ 50 mM组氨酸，0 ~ 2 M NH₄Cl。梯度洗脱最好在起始缓冲液的恒定pH下进行。

2.3 螯合剂洗脱：EDTA、EGTA等螯合剂会与金属离子产生作用(yòng)力，导致蛋白被洗脱下来。这种方法不能(néng)使不同的蛋白分(fēn)离，此外会影响蛋白吸附，导致融合蛋白不能(néng)挂柱。

2.4 所有(yǒu)上述情况中，缓冲液中必须加入0.15 ~ 0.5 M的NaCl 以消除离子交换作用(yòng)。

2.5 当螯合离子配基是Cu²⁺时，有(yǒu)以下的三种操作方式。

降低pH洗脱：

上样缓冲液：50 mM NaH₂PO₄，0.5 M NaCl，pH 7.4

洗脱缓冲液：50 mM NaH₂PO₄，0.5 M NaCl，pH 3.5

竞争性洗脱：

上样缓冲液：50 mM NaH₂PO₄，1 M NaCl，pH 7.4

洗脱缓冲液：50 mM NaH₂PO₄，1 M NH₄Cl，pH 7.4

螯合剂洗脱：

上样缓冲液：50 mM NaH₂PO₄，0.5 M NaCl，pH 7.4

洗脱缓冲液：50 mM NaH₂PO₄，0.5 M NaCl，50 mM EDTA，pH 7.4

注：配制的缓冲液需要用(yòng)NaOH或HCl调节至要求的pH。使用(yòng)降低pH和螯合剂洗脱会使金属离子脱落，下次使用(yòng)得重新(xīn)螯和金属离子，最常用(yòng)的為(wèi)竞争性洗脱。

再生、清洗：

1. 凝胶的再生

1.1 多(duō)次使用(yòng)后或需要更换螯合的金属离子，必须将胶脱镍再生。脱镍方法：用(yòng)5 ~ 10个柱體(tǐ)积蒸馏水淋洗柱子，再用(yòng)5 ~ 10个柱體(tǐ)积的100 mM EDTA淋洗柱子，再用(yòng)2 ~ 3个柱體(tǐ)积的0.5 M NaCl洗掉残留的EDTA。

1.2 多(duō)次使用(yòng)的柱子脱镍后一般需要清洗。清洗方法：用(yòng)0.1 ~ 1.0 M NaOH反向清洗柱子，流速50 cm/h，保持1 ~ 2 h，能(néng)去除结合强的杂质，同时也能(néng)去除热源。

1.3 清洗后需要重新(xīn)螯合金属离子。螯合方法：用(yòng)2 ~ 5个柱體(tǐ)积的蒸馏水充分(fēn)平衡脱镍的柱子，用(yòng)0.1 ~ 0.3M金属盐溶液过柱5 ~ 10个柱體(tǐ)积螯合金属，螯合后用(yòng)5 ~ 10个柱體(tǐ)积蒸馏水淋洗，去除未螯合的金属离子。

2.在位清洗

2.1 除去因离子交换作用(yòng)吸附的蛋白，用(yòng)2 ~ 3个柱體(tǐ)积2 M 的NaCl溶液反向清洗柱子。

2.2 除去强的疏水性蛋白和脂质等，用(yòng)4个柱體(tǐ)积的70%的乙醇或者30%的异丙醇反向清洗柱子。

2.3 除去蛋白沉淀、疏水性蛋白，参照凝胶的再生。

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