纳米抗體(tǐ)发展史

一、纳米抗體(tǐ)的发现

  比利时科(kē)學(xué)家Hamers-Casterman及其团队于1993年在《自然》杂志(zhì)上，首次公开发表了关于纳米抗體(tǐ)的研究结果：在骆驼血液中的抗體(tǐ)，有(yǒu)一半没有(yǒu)轻链，这些“重链抗體(tǐ)”能(néng)像正常抗體(tǐ)一样与抗原等靶标紧紧结合，而且不像单链抗體(tǐ)那样互相聚集。随后Andrew等科(kē)學(xué)家从鲨鱼血液中也发现了这种小(xiǎo)型抗體(tǐ)。

针对这种天然缺失轻链的重链抗體(tǐ)，克隆其重链可(kě)变區(qū)（Variable Region of the Heavy Chain，VH）可(kě)以得到只有(yǒu)重链可(kě)变區(qū)组成的单域抗體(tǐ)（Variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH），具有(yǒu)与原重链抗體(tǐ)相当的结构稳定性，且与抗原的结合活性不变，是已知的可(kě)结合目标抗原的最小(xiǎo)单位，分(fēn)子量约為(wèi)12~15 kDa，也被称作纳米抗體(tǐ)(Nanobody, Nb)。

相比于传统抗體(tǐ)，纳米抗體(tǐ)的活性结合區(qū)域较長(cháng)，其温度稳定性及有(yǒu)机溶剂耐受性更强，部分(fēn)还可(kě)耐受蛋白酶，在更广的酸碱范围内保持活性。此外，纳米抗體(tǐ)的制备可(kě)选择使用(yòng)工程菌表达，相较于传统抗體(tǐ)的杂交瘤细胞制备方式，具有(yǒu)易表达、易于基因工程改造等优点。

二、纳米抗體(tǐ)的独特优势

1、分(fēn)子质量小(xiǎo)、更强的组织穿透力：纳米抗體(tǐ)的分(fēn)子质量小(xiǎo)，这使得它们能(néng)够更容易地穿透生物(wù)屏障，如细胞膜和组织，从而更有(yǒu)效地到达目标位置。

2、易人源化免疫原性低：编码骆驼来源的纳米抗體(tǐ)的基因与人类3型VH结构域(VH3)具有(yǒu)高度的同源性，在人體(tǐ)内的免疫原性较弱。

3、高稳定性：纳米抗體(tǐ)在极端条件下，如高温、低温、有(yǒu)机溶剂和酸碱环境中，都能(néng)保持其结构和功能(néng)。这种高稳定性使得纳米抗體(tǐ)在储存和运输过程中更加方便，同时也為(wèi)它们在恶劣环境下的应用(yòng)提供了可(kě)能(néng)。

4、高亲和力：VHH与常规的VH相比，有(yǒu)更長(cháng)的互补决定區(qū)3(CDR3)，这种長(cháng)CDR3结构易形成凸环结构，可(kě)以结合一些难以结合的抗原表位，因此弥补了纳米抗體(tǐ)由于轻链缺失而导致的抗原结合能(néng)力下降的缺陷。

5、适于工业化生产：纳米抗體(tǐ)易在细菌、酵母等表达系统中进行重组表达，此外，其生产过程相对简单，成本较低，有(yǒu)利于规模化生产。

三、纳米抗體(tǐ)的分(fēn)类

利用(yòng)纳米抗體(tǐ)所具有(yǒu)的特性，对其进行基因改造，可(kě)转变為(wèi)多(duō)种形式，携带某些特定的结构，用(yòng)于疾病的诊断和治疗。

1、单价纳米抗體(tǐ)

用(yòng)特异性的抗原从纳米抗體(tǐ)库中筛选得到的抗原特异性的纳米抗體(tǐ)，因其表面有(yǒu)大量的亲水残基，能(néng)保持严格的单體(tǐ)结构，且仅以这种单體(tǐ)形式就能(néng)高特异性、高亲和力地与其抗原相结合。

2、多(duō)价和多(duō)特异性纳米抗體(tǐ)

多(duō)价抗體(tǐ)是识别同一种表位的单价抗體(tǐ)的聚合物(wù)，比单价抗體(tǐ)具有(yǒu)更高的抗原亲和力；多(duō)特异性抗體(tǐ)是识别不同表位的单价抗體(tǐ)的聚合物(wù)，能(néng)结合不同靶目标或同一靶目标的不同表位，比单价抗體(tǐ)具有(yǒu)更高的抗原识别能(néng)力。而纳米抗體(tǐ)结构简单，只有(yǒu)一个结构域，可(kě)通过短小(xiǎo)的连接序列聚合在一起,从而转换成多(duō)价和多(duō)特异性的形式。

3、融合型纳米抗體(tǐ)

纳米抗體(tǐ)具有(yǒu)严格的单體(tǐ)特点且其相对分(fēn)子质量很(hěn)小(xiǎo)，很(hěn)容易通过基因工程技术与其他(tā)结构结合形成新(xīn)的融合分(fēn)子，如能(néng)延長(cháng)其半衰期的酶、抗菌肽或显影物(wù)质等。在新(xīn)的融合分(fēn)子中，纳米抗體(tǐ)与其靶抗原定向结合，与纳米抗體(tǐ)融合的部分(fēn)就能(néng)发挥相应的功能(néng)。进行疾病治疗时，可(kě)以通过基因技术将纳米抗體(tǐ)VHH和寿命较長(cháng)的分(fēn)子融合在一起，可(kě)以提高纳米抗體(tǐ)在血液中的存在时间即延長(cháng)其半衰期，从而达到更好的治疗效果。

四、纳米抗體(tǐ)的应用(yòng)

纳米抗體(tǐ)作為(wèi)一种新(xīn)兴的生物(wù)纳米技术，凭借其结构和功能(néng)的特异性，加之极高的稳定性和亲和力，在很(hěn)多(duō)方面具有(yǒu)广泛的应用(yòng)。包括生物(wù)医學(xué)研究、临床诊断和治疗、药物(wù)递送以及生物(wù)传感等。

纳米抗體(tǐ)可(kě)以用(yòng)于识别和定量细胞表面以及组织中的特定抗原。在免疫组化和免疫荧光染色中，用(yòng)于标记和追踪细胞内和细胞间的特定蛋白。纳米抗體(tǐ)可(kě)以作為(wèi)分(fēn)子成像试剂，用(yòng)于肿瘤和其他(tā)疾病的早期诊断。在免疫层析检测中，纳米抗體(tǐ)可(kě)以用(yòng)作捕获或检测抗體(tǐ)，用(yòng)于快速检测病原體(tǐ)或生物(wù)标志(zhì)物(wù)。纳米抗體(tǐ)作為(wèi)分(fēn)子成像试剂也具有(yǒu)独特的优势，用(yòng)于肿瘤和其他(tā)疾病的早期诊断，在临床前和临床模型中都显示出巨大的潜力，正逐渐成為(wèi)新(xīn)一代肿瘤临床诊断技术的重要工具。

此外，将治疗性化合物(wù)与诊断性放射性示踪剂结合，并进行诊断扫描，该化合物(wù)在肿瘤细胞中的积累可(kě)以实现可(kě)视化。放射性标记的纳米抗體(tǐ)可(kě)以用(yòng)于识别特定的肿瘤相关生物(wù)标志(zhì)物(wù)，从而帮助癌症诊断和确定适当的治疗方法。纳米抗體(tǐ)可(kě)以迅速扩散到组织中，并特异性地在靶组织中积累，快速产生高对比度图像，从而对患者进行早期诊断。

纳米抗體(tǐ)作為(wèi)药物(wù)载體(tǐ)，也具有(yǒu)一些传统递送系统所不具备的优势。通过调控其结构和功能(néng)，靶向输送药物(wù)到病变部位，减少对正常组织的损害，实现更高效的药物(wù)递送。与传统药物(wù)递送系统相比，纳米药物(wù)递送系统因其尺寸、形状、材料等的特殊性，可(kě)有(yǒu)效改善药物(wù)的药代动力學(xué)和药效學(xué)性能(néng)，进而提高疗效。

五、纳米抗體(tǐ)制备流程

1、设计抗原免疫驼源动物(wù)

以大分(fēn)子或小(xiǎo)分(fēn)子结构為(wèi)基础设计半抗原，并偶联蛋白制成抗原去免疫驼源动物(wù)，一般免疫过程要进行多(duō)次，以确保动物(wù)體(tǐ)内产生足够的针对特定抗原的淋巴细胞。

2、提取RNA并建立噬菌體(tǐ)文(wén)库

先获取免疫后动物(wù)的外周血液，提取血液中淋巴细胞中的RNA，通过反转录生成cDNA，利用(yòng)PCR扩增特定的抗體(tǐ)基因區(qū)域（通常是VHH），将扩增的基因片段克隆到噬菌體(tǐ)表达载體(tǐ)中，建立噬菌體(tǐ)文(wén)库，经噬菌體(tǐ)展示技术得到多(duō)株阳性克隆细胞株。

3、筛选阳性克隆

利用(yòng)噬菌體(tǐ)展示技术，将抗體(tǐ)文(wén)库中的噬菌體(tǐ)表达在细菌表面。进一步通过合适的筛选手段，筛选出能(néng)够特异性结合抗原的噬菌體(tǐ)克隆，将用(yòng)于进一步的表达和纯化。

4、纳米抗體(tǐ)的表达纯化

将阳性克隆的基因转入大肠杆菌或其他(tā)表达系统进行表达，达到适当的表达水平后，收集和裂解含有(yǒu)表达纳米抗體(tǐ)的细菌细胞，随后制定合适的纯化策略，完成对纳米抗體(tǐ)的纯化，获得符合要求的产品。

随着纳米抗體(tǐ)研究的不断深入，其应用(yòng)场景也越来越广阔。将纳米抗體(tǐ)与其他(tā)的科(kē)研、诊断、治疗手段相结合，将会产生无限的可(kě)能(néng)性，这也是科(kē)學(xué)家们积极探索的研究热点。