分(fēn)离纯化填料助力抗體(tǐ)研发

    制药工具|纽龙生物(wù)助力抗體(tǐ)研发

一、抗體(tǐ)的定义和分(fēn)类

1、抗體(tǐ)：

传统抗體(tǐ)（antibody，Ab）是机體(tǐ)的免疫系统在抗原刺激下由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分(fēn)化成的浆细胞所产生的、可(kě)与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白，由2条重链和2条轻链通过二硫键连接形成。

抗體(tǐ)可(kě)以分(fēn)為(wèi)两段：Fab段和Fc段，Fab段為(wèi)抗原结合片段（fragment of antigen binding，Fab），由一个完整的轻链和重链的VH和CH1结构域组成。Fc段為(wèi)可(kě)结晶段（fragment crystallizable，Fc）相当于Ig的CH2和CH3结构域，是Ig与效应分(fēn)子或者细胞相互作用(yòng)的部位。Fab段包含完整的可(kě)变區(qū)，以及恒定區(qū)的CH1區(qū)域。Fc段仅指Ig恒定區(qū)CH2和CH3的區(qū)域。抗體(tǐ)的可(kě)变區(qū)（Variable Region，V區(qū)）是抗體(tǐ)结合抗原的位置，这些可(kě)变區(qū)氨基酸的组成和排列决定决定着抗體(tǐ)的抗原特异性。抗體(tǐ)的恒定區(qū)（Constant Region， C區(qū)）可(kě)以与细胞表面受體(tǐ)或补體(tǐ)系统蛋白相互作用(yòng)，从而触发宿主效应功能(néng)，比如裂解入侵细胞或吞噬外来病原。

2、抗體(tǐ)的种类和特性

a、天然抗體(tǐ)：

人或动物(wù)未经明显感染或人工注射抗原而天然存在于體(tǐ)内的各种抗體(tǐ)，根据重链类型不同，可(kě)将其分(fēn)為(wèi)五类，即IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。

b、多(duō)克隆抗體(tǐ)（polyclonal antibody，pAb）：

天然抗原往往具有(yǒu)多(duō)种表位，刺激机體(tǐ)产生的抗體(tǐ)中包含针对多(duō)种不同抗原表位的Ig，系由多(duō)个B细胞克隆产生的抗體(tǐ)混合物(wù)，故称為(wèi)多(duō)克隆抗體(tǐ)。多(duō)克隆抗體(tǐ)识别位点多(duō)但特异性不高。

c、单克隆抗體(tǐ)（monoclonal antibody, mAb）：

由一个B细胞克隆产生的识别单一抗原表位的同源抗體(tǐ)，称為(wèi)单克隆抗體(tǐ)（以下简称单抗），一般通过杂交瘤技术制备，具有(yǒu)结构高度均一、抗原结合部位和同种型相同、纯度高、特异性强和效价高等特点。 单抗发展到现在可(kě)以分(fēn)為(wèi)四代，分(fēn)别為(wèi)：鼠源化单抗、人鼠嵌合单抗、人源化单抗和全人源化单抗。

d、基因工程抗體(tǐ)：

天然抗體(tǐ)在实际应用(yòng)过程中，由于物(wù)种间的差异性，在成药性方面会引起部分(fēn)人群的过敏或排异反应，从而导致药物(wù)开发的失败。基因工程抗體(tǐ)是近些年来，為(wèi)降低异源性抗體(tǐ)引发排异反应的潜在风险，从而基于基因的分(fēn)子克隆技术分(fēn)别表达制备抗體(tǐ)重链和轻链片段，并进一步制备而成的人源化抗體(tǐ)。与杂交瘤技术生产的单克隆抗體(tǐ)相比，重组抗體(tǐ)具有(yǒu)高批间一致性、无动物(wù)源生产、易于工程化改造等优势。

e、纳米抗體(tǐ)：

纳米抗體(tǐ)是在羊驼外周血液中存在的一种天然缺失轻链的抗體(tǐ)，该抗體(tǐ)只包含一个重链可(kě)变區(qū)(VHH)和两个常规的CH2与CH3區(qū)，但却不像人工改造的单链抗體(tǐ)片段 (scFv) 那样容易相互沾粘，甚至聚集成块。更重要的是单独克隆并表达出来的VHH结构具有(yǒu)与原重链抗體(tǐ)相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是已知的可(kě)结合目标抗原的最小(xiǎo)单位，具有(yǒu)结构功能(néng)上的独特优势，在疾病诊断、癌症和感染性疾病等方面均展现了良好的防治效果。

二、抗體(tǐ)药分(fēn)类

抗體(tǐ)药是指利用(yòng)人工合成的抗體(tǐ)分(fēn)子来治疗疾病的药物(wù)，既有(yǒu)传统抗體(tǐ)（多(duō)抗、单抗等），又(yòu)有(yǒu)非传统新(xīn)型抗體(tǐ)（纳米抗體(tǐ)、基因工程抗體(tǐ)等），能(néng)够针对特定的疾病进行治疗。具有(yǒu)特异性高、不良反应低等特点，是目前新(xīn)药研发的主要领域。依据抗體(tǐ)的特征及制备过程，可(kě)以分(fēn)為(wèi)单抗、双抗、ADC、Fc融合蛋白、抗體(tǐ)片段等等。

1、单克隆抗體(tǐ)

单克隆抗體(tǐ)药物(wù)是抗體(tǐ)类药物(wù)中最重要的一类。1975年英國(guó)科(kē)學(xué)家Milstein和法國(guó)科(kē)學(xué)家Kohler将产生抗體(tǐ)的B淋巴细胞同肿瘤细胞融合形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞具备亲本细胞的特性，既可(kě)以产生抗體(tǐ)，又(yòu)具有(yǒu)肿瘤细胞无限增殖的特性，从而持续分(fēn)泌单抗。单抗优点众多(duō)，在抗體(tǐ)临床应用(yòng)过程中具有(yǒu)划时代的意义，两位科(kē)學(xué)家因此被授予1984年的诺贝尔生理(lǐ)學(xué)或医學(xué)奖。之后单抗经历了鼠源化单抗、人鼠嵌合单抗、人源化单抗和全人源单抗等不同发展阶段。

a.鼠源化单抗：

1986年，第一个被美國(guó)FDA批准的单抗药Orthoclone OKT3问世，用(yòng)于防止肾脏移植后的宿主排斥反应。OrthocloneOKT3来自于小(xiǎo)鼠，是第一代鼠源化单抗，用(yòng)于人身上会有(yǒu)强烈的免疫反应，人體(tǐ)产生的免疫排斥使单抗药很(hěn)快从病人體(tǐ)内被清除掉，大大降低了它们应有(yǒu)的疗效，尤其在治疗慢性疾病需要長(cháng)期服用(yòng)的情况下，鼠源化单抗药在后续注射时疗效甚微，因此，早期单抗药的市场表现并不尽人意。

b.人鼠嵌合单抗：

20世纪90年代，為(wèi)了解决鼠源化抗體(tǐ)的差异化问题，科(kē)學(xué)家提出了人源化抗體(tǐ)的概念。采用(yòng)抗體(tǐ)蛋白工程技术，对小(xiǎo)鼠单抗的部分(fēn)氨基酸序列进行置换，或加以拼接，获得既不引起人免疫排斥，又(yòu)不降低对抗原的亲和性的重组抗體(tǐ)。人鼠嵌合抗體(tǐ)是指用(yòng)人抗體(tǐ)的恒定區(qū)取代小(xiǎo)鼠的恒定區(qū)，约33%的氨基酸序列来自小(xiǎo)鼠，其余67%序列為(wèi)人源的序列。人鼠嵌合单抗相比鼠源化单抗，免疫原性大幅下降，因此副作用(yòng)降低，半衰期加長(cháng)，但是由于人鼠嵌合抗體(tǐ)仍保留了30%左右的鼠源序列，还是会引起一定程度的免疫反应。 

c.人源化单抗：

為(wèi)了进一步降低抗體(tǐ)的鼠源性，人们又(yòu)开发了重构抗體(tǐ)技术生产重构人源化抗體(tǐ)。人源化抗體(tǐ)中人源序列的比例可(kě)以高达90%，即拿(ná)到针对某抗原的小(xiǎo)鼠抗體(tǐ)后，只取其识别抗原的區(qū)域（CDR區(qū)域），移植到人源抗體(tǐ)中。人源化单抗比人鼠嵌合单抗更有(yǒu)优势，引起免疫排斥或超敏的风险更低。但是目前缺乏通用(yòng)的制备方法，每个抗體(tǐ)分(fēn)子的人源化，都需要个案分(fēn)析、分(fēn)子建模、大量的改造和试错，而且由于鼠源序列的存在，还是不能(néng)完全避免免疫排斥或超敏的风险。

d.全人源化单抗：

全人源化单抗是100%人源性抗體(tǐ)，它是用(yòng)于人类疾病治疗的理(lǐ)想抗體(tǐ)。随着重组DNA技术的发展，各种抗體(tǐ)人源化技术迅速发展，譬如噬菌體(tǐ)展示文(wén)库和转基因小(xiǎo)鼠技术等的成熟应用(yòng)，使全人源化单抗的产生成為(wèi)可(kě)能(néng)，2002年第一个全人源化抗體(tǐ)阿达木(mù单抗（艾伯维）上市。

简而言之，噬菌體(tǐ)展示技术先通过PCR技术建立一个以噬菌體(tǐ)基因组為(wèi)载體(tǐ)的、表达无数个人源抗體(tǐ)可(kě)变區(qū)的基因库。当大肠杆菌被转染后，千百万个噬菌體(tǐ)被释放出来，每个噬菌體(tǐ)表面呈现一个独特的抗體(tǐ)可(kě)变區(qū)片断。含有(yǒu)这些噬菌體(tǐ)混合物(wù)的溶液，在流过附着特定抗原的固态基质后，粘在基质表面，无法被清洗的往往是呈现特异性抗體(tǐ)的噬菌體(tǐ)颗粒，特异性抗體(tǐ)的基因再进一步被扩增、纯化即可(kě)得到目标抗體(tǐ)的信息。

转基因小(xiǎo)鼠技术通过转基因手段把人的抗體(tǐ)基因片段转入小(xiǎo)鼠體(tǐ)内，并进行有(yǒu)效的重排和表达，这些片段能(néng)与小(xiǎo)鼠细胞的免疫系统信号机制相互作用(yòng)，使得小(xiǎo)鼠在受抗原刺激后，表达并活化 B 细胞分(fēn)泌人抗體(tǐ)。基于这种技术制备的抗體(tǐ)，具有(yǒu)较高的靶结合亲和力，同时，用(yòng)转基因小(xiǎo)鼠生产候选抗體(tǐ)药物(wù)时间较短，费用(yòng)较低，较于传统方式具有(yǒu)一定的技术优势。

2、双特异性抗體(tǐ) 

双特异性抗體(tǐ)（以下简称双抗）是含有(yǒu)两个特异性抗原结合位点的人工抗體(tǐ)，其中一个位点可(kě)与靶细胞表面抗原结合，另一个位点则可(kě)与载荷物(wù)（如效应细胞，分(fēn)子等）结合。通过同时识别两个标靶，双抗可(kě)以作為(wèi)一个媒介双重定向免疫效应细胞，如自然杀伤细胞和T细胞，加强对肿瘤细胞的杀伤功能(néng)。如Trion Pharma公司的卡托索单抗和安进公司的倍利妥等。

3、抗體(tǐ)偶联药物(wù)（antibody drug conjugate, ADC） 

抗體(tǐ)偶联药物(wù)(ADC)是由靶向特异性抗原的单抗与小(xiǎo)分(fēn)子细胞毒性药物(wù)通过连接子偶联形成，通过mAb对肿瘤细胞的特异性使得小(xiǎo)分(fēn)子药物(wù)在肿瘤组织发挥作用(yòng)，能(néng)够有(yǒu)效降低传统小(xiǎo)分(fēn)子药物(wù)高毒副作用(yòng)并提高整體(tǐ)治疗效率。ADC可(kě)以结合抗體(tǐ)的高特异性和小(xiǎo)分(fēn)子化學(xué)药的有(yǒu)效性。ADC由三部分(fēn)构成：抗體(tǐ)、小(xiǎo)分(fēn)子药物(wù)和连接臂。抗體(tǐ)要有(yǒu)高度的靶向特异性，识别细胞表面抗原后，还能(néng)诱导细胞内吞，将整个复合物(wù)内吞到溶酶體(tǐ)内，复合物(wù)在溶酶體(tǐ)内被分(fēn)解后，将小(xiǎo)分(fēn)子药物(wù)释放出来发挥作用(yòng)。这种药物(wù)运输體(tǐ)系能(néng)够改善小(xiǎo)分(fēn)子化學(xué)药物(wù)的代謝(xiè)动力學(xué)，提高药物(wù)的特异性，减少副作用(yòng)。但ADCs的开发有(yǒu)一定的技术困难，特别是连接臂的构建。

4、Fc融合蛋白 

Fc融合蛋白也是基于传统单抗药物(wù)发展起来的一种改进型药物(wù)，它是指利用(yòng)基因工程等技术将某种具有(yǒu)生物(wù)活性的功能(néng)蛋白分(fēn)子与Fc片段融合而产生的新(xīn)型重组蛋白，其不仅保留了功能(néng)蛋白分(fēn)子的生物(wù)學(xué)活性，还具有(yǒu)一些抗體(tǐ)的性质，如通过结合相关Fc受體(tǐ)延長(cháng)半衰期和引发抗體(tǐ)依赖细胞介导的细胞毒性效应等。如再生元的Eylea（阿柏西普），是由人體(tǐ)血管内皮细胞生長(cháng)因子（VEFG）受體(tǐ)1和2的胞外區(qū)与人體(tǐ)免疫球蛋白G1的可(kě)结晶片段融合而成的重组融合蛋白，用(yòng)于治疗眼科(kē)疾病等。

5、抗體(tǐ)片段

抗體(tǐ)片段药物(wù)也是基于传统单抗药物(wù)发展起来的一种改进型药物(wù)。抗體(tǐ)片段可(kě)以由完整的抗體(tǐ)经不同蛋白酶切割后得到，也可(kě)以通过基因工程得到。典型的抗體(tǐ)片段有(yǒu)如下几种：F(ab’)2、Fab、Fab’、Fv 、rIgG、Fc 。

F(ab’)2、Fab、Fab’和 Fv 是可(kě)以从 IgG 和 IgM 的可(kě)变區(qū)产生的抗原结合片段。这些抗原结合片段的分(fēn)子量（MW）、化合价和 Fc 含量不同。Fc 片段完全由免疫球蛋白的重链恒定區(qū)产生。这些片段和其他(tā)一些独特片段结构可(kě)以从五聚體(tǐ) IgM 产生，包括’IgG’型片段、反向’IgG’型片段和五聚體(tǐ) Fc 片段。

三、抗體(tǐ)纯化工艺流程

抗體(tǐ)分(fēn)离纯化的主要目的是将抗體(tǐ)与工艺相关杂质和产品相关杂质分(fēn)离，且将潜在内源病毒样颗粒和外源病毒进行灭活去除，最终获得高纯度、低潜在危害的抗體(tǐ)药物(wù)。工艺相关杂质包括培养基成分(fēn)、培养过程中的添加物(wù)、细胞、细胞碎片、宿主细胞蛋白、宿主细胞核酸及纯化过程中引入的其他(tā)杂质等；产品相关杂质包括抗體(tǐ)蛋白降解片段、聚集體(tǐ)、异构體(tǐ)等；潜在病毒主要是宿主细胞自身的内源性病毒样颗粒及工艺过程中可(kě)能(néng)引入的外源病毒。抗體(tǐ)纯化过程中，一般采用(yòng)三步纯化策略（图7）：

捕获（粗纯）：分(fēn)离、浓缩、稳定目标蛋白。产品被浓缩转移到一个可(kě)以维持其效能(néng)、活性的环境，最好可(kě)以去除其他(tā)关键杂质。

中间产品纯化：去除大部分(fēn)性质相似的杂质，例如其他(tā)蛋白质和核酸、内毒素和病毒。

精纯：去除一些微量的和分(fēn)子量相近的杂质和多(duō)聚體(tǐ)。

四、单抗纯化注意事项

单抗纯化方法的选择，既要考虑单抗基本特性因素，同时又(yòu)要考虑单抗生产體(tǐ)系特性因素，综合分(fēn)析选择单抗纯化的工艺。

每个单抗，其分(fēn)子量、等電(diàn)点、疏水性、糖基化、pH值稳定性、溶解度、多(duō)聚體(tǐ)复合物(wù)的形成等生化性质各不相同。单抗纯化方法的选择，要基于上述单抗生化性质因素选择制定纯化工艺。

单抗溶解度生化性质因素：有(yǒu)些单抗在温度低于37℃时溶解度会降低，易结晶，在纯化工艺选择时，应避免冷室操作。

单抗pH值稳定性生化性质因素：一般情况下单抗，在水溶液或一般的缓冲液中都比较稳定，但应避免极端的pH值，如低的pH值会促使蛋白聚集，过高的pH值会促使脱酰胺酶降解单抗，在纯化工艺选择时，应根据单抗pH值稳定性因素选择纯化工艺，避免极端的PH值溶液。

单抗等電(diàn)点生化性质因素：大多(duō)数单抗等電(diàn)点高于一般血清蛋白，使用(yòng)阳离子交换层析捕获浓缩抗體(tǐ)或使用(yòng)阴离子交换层析可(kě)除去大部分(fēn)杂质蛋白、核酸和内毒素；对于CHO细胞表达的基因工程抗體(tǐ)，由于细胞培养过程带来的糖基化的不均一以及后期其他(tā)的翻译后修饰等作用(yòng)，存在的等電(diàn)点不同的多(duō)抗體(tǐ)变體(tǐ)，可(kě)用(yòng)离子交换层析根据带電(diàn)性质的不同有(yǒu)效除去这些变體(tǐ)，使产品质量更均一。

单抗的疏水性生化性质因素：大多(duō)数单抗疏水性较强，可(kě)以在0.5~1.0 M硫酸铵存在条件下结合疏水介质，让大部分(fēn)杂质蛋白流穿；可(kě)以先在30%~50%硫酸铵时盐析，重溶后直接进行疏水层析纯化；不同抗體(tǐ)疏水性程度也不同，可(kě)以依据具體(tǐ)抗體(tǐ)的疏水性选择合适的填料和缓冲液體(tǐ)系。

单抗的其他(tā)生化性质因素：基于单抗基本特性选择纯化工艺除以上单抗的溶解度因素、pH值稳定性因素、等電(diàn)点因素、疏水性因素外，单抗的分(fēn)子量、糖基化、多(duō)聚體(tǐ)复合物(wù)的形成等生化性质也应加以考虑。

基于单抗生产宿主因素选择纯化工艺：可(kě)供选择的单抗生产宿主包括直接免疫动物(wù)如鼠/兔、杂交瘤细胞、哺乳动物(wù)细胞、酵母、转基因动 物(wù)、转基因植物(wù)等。单抗生产宿主不同，则单抗生产产生的主要相关杂质也不同，纯化清除工艺的也不相同。例如，以酵母作為(wèi)单抗生产宿主产生的抗體(tǐ)：对以酵母作為(wèi)单抗生产宿主，单抗生产的主要杂质為(wèi)宿主细胞蛋白及培养基中蛋白，针对这类杂质，采用(yòng)中空纤维膜做样品的澄清，之后用(yòng)离子交换结合疏水层析工艺进行纯化效果比较好。以转基因植物(wù)作為(wèi)单抗生产宿主产生的抗體(tǐ)：对于以转基因植物(wù)作為(wèi)单抗生产宿主，单抗生产的主要杂质為(wèi)色素、植物(wù)细胞杂质蛋白，针对这类杂质，采用(yòng)亲和层析纯化植物(wù)表达抗體(tǐ)效果比较好，对于少量吸附在亲和胶體(tǐ)上的色素，可(kě)用(yòng)分(fēn)子筛去除。

以杂交细胞瘤作為(wèi)单抗生产宿主产生的抗體(tǐ)：以杂交细胞瘤作為(wèi)单抗生产宿主产生的抗體(tǐ)，其主要相关杂质為(wèi)培养基内的杂质蛋白、转铁蛋白、酶、小(xiǎo)牛IgG、酯类以及宿主蛋白和核酸，这类单抗用(yòng)于诊断试剂和治疗性单抗。其中治疗性单抗纯度要求较高（95%~99%），需要多(duō)步骤、多(duō)维层析去除宿主杂质。其中转铁蛋白、小(xiǎo)牛IgG与目标抗體(tǐ)性质接近，污染问题十分(fēn)显著，一般可(kě)通过优化疏水层析和离子交换层析去除；若白蛋白的量较多(duō)，可(kě)先用(yòng)蛋白A蛋白G等亲和层析法直接捕获抗體(tǐ)。

作為(wèi)单抗生产宿主，除以上以酵母作為(wèi)单抗生产宿主、以转基因植物(wù)作為(wèi)单抗生产宿因素、以杂交细胞瘤作為(wèi)单抗生产宿因素外，还有(yǒu)其他(tā)单抗宿主如：直接免疫动物(wù)如鼠/兔、哺乳动物(wù)细胞、转基因动物(wù)等，选择纯化工艺时，应结合宿主优缺点及主要相关杂质特性等选择纯化策略。

总之，单抗纯化工艺的选择，既要考虑单抗體(tǐ)基本生化性质因素，同时又(yòu)要考虑单抗生产宿主的特性因素，综合分(fēn)析选择单抗纯化的工艺。

五、纽龙产品介绍

杭州纽龙生物(wù)科(kē)技有(yǒu)限公司是一家专注于重组蛋白以及蛋白纯化填料研发生产的國(guó)家高新(xīn)技术企业。基于自有(yǒu)技术平台，实现填料与配基的双重突破，开发出一系列可(kě)用(yòng)于不同抗體(tǐ)的纯化填料，如Protein A、Protein G、Protein L、耐碱Protein A等，性能(néng)可(kě)比可(kě)靠，批间差小(xiǎo)，供货持续稳定，可(kě)以满足客户在抗體(tǐ)纯化领域的不同需求，如有(yǒu)需要，欢迎拨打0571-82872376联系。

参考文(wén)献：

[1]  A brief introduction of IgG-like bispecific antibody purification: Methods for removing product-related impurities，Yifeng Li，/doi.org/10.1016/j.pep.2018.11.01

[2]  Tiller KE, Tessier PM. Advances in Antibody Design. Annu Rev Biomed Eng. 2015;17:191-216. doi: 10.1146/annurev-bioeng-071114-040733. Epub 2015 Aug 14. PMID: 26274600; PMCID: PMC5289076.

[3]  Hober S, Nord K, Linhult M. Protein A chromatography for antibody purification. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2007 Mar 15;848(1):40-7. doi: 10.1016/j.jchromb.2006.09.030. Epub 2006 Oct 9. PMID: 17030158.

[4] 医药筆(bǐ)记：2021年FDA批准的8款抗體(tǐ)新(xīn)药