NRPB76 IMAC琼脂糖凝胶FF

相关介绍： 

　　螯合金属离子亲和层析（IMAC）琼脂糖凝胶FF具有(yǒu)螯合金属离子的能(néng)力，如螯合Cu²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Fe³⁺等，螯合金属离子后可(kě)用(yòng)于富含组氨酸、色氨酸、半胱氨酸的蛋白质纯化，其中最常见的是用(yòng)于融合了6-8个组氨酸标签的蛋白质纯化。与IDA琼脂糖凝胶FF相比，IMAC琼脂糖凝胶FF一般可(kě)以更牢固的结合金属离子，在纯化标签蛋白方面，有(yǒu)可(kě)能(néng)获得更高纯度的样品。

技术指标：

使用(yòng)方法：

1、色谱柱装填

（1）所有(yǒu)需要用(yòng)到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液體(tǐ)最好做脱气处理(lǐ)。

（2）在柱子下端加入蒸馏水，以除去柱子中的空气，关闭柱子出口，在柱内保留少量的蒸馏水。

（3）将琼脂糖凝胶连续倒入柱子时，要用(yòng)玻璃棒的紧靠柱子内壁引流，以减少气泡的产生，让填料先自然沉降，建议柱床高度不超过20cm。

（4）柱压不超过0.3MPa，如果装柱系统中无法测柱压，则正常使用(yòng)流速填装。

（5）填装好的IMAC琼脂糖凝胶FF柱用(yòng)5个柱體(tǐ)积蒸馏水清洗，使用(yòng)的流速建议為(wèi)100cm/h。

2 螯合金属离子

（1）根据需要选择金属盐，一般配置0.1-0.2M金属盐溶液，常见的有(yǒu)CuSO₄、ZnSO₄、NiSO₄、CoCl₂等。注意金属盐溶液的pH以偏酸性為(wèi)宜（如pH4-6，Fe³⁺一般需要pH3），防止在螯合时pH上升产生沉淀。

（2）蒸馏水清洗后的IMAC琼脂糖凝胶FF用(yòng)1-3个柱體(tǐ)积金属盐溶液过柱螯合金属离子，然后用(yòng)5个柱體(tǐ)积以上的蒸馏水清洗层析柱，去除游离的金属盐溶液。

（3）用(yòng)5个柱體(tǐ)积以上的乙酸缓冲液（20mM 乙酸-乙酸钠，1M 氯化钠，pH4.0）清洗，去除结合不牢固的金属离子，减少在使用(yòng)过程的脱落。

（4）处理(lǐ)完后可(kě)用(yòng)结合缓冲液平衡层析柱，用(yòng)于目标蛋白的纯化。

3、纯化目标蛋白

（1）选择缓冲液：一般选用(yòng)pH6-8的结合缓冲液，常用(yòng)缓冲液有(yǒu)10-00mM 磷酸钠缓冲液、20-200mM Tris-HCl缓冲液等。在缓冲液中一般要加入0.15-0.5M的NaCl，以消除离子交换作用(yòng)。在初次使用(yòng)IMAC琼脂糖凝胶FF，推荐使用(yòng)50mM PBS（50 mM NaH₂PO₄，0.5M NaCl，NaOH调节pH 7.4）作為(wèi)结合缓冲液。

（2）样品处理(lǐ)：样品的缓冲液应与所选结合缓冲液一致。為(wèi)保证缓冲液一致，可(kě)以在结合缓冲液中破碎细菌、或调解pH与结合缓冲液一致、或交换至结合缓冲液（常用(yòng)方法有(yǒu)透析、超滤、脱盐柱换液等）、或用(yòng)结合缓冲液稀释2-10倍等。样品上柱前应0.45μm过滤。

（3）平衡上样：螯合金属离子的IMAC琼脂糖凝胶FF用(yòng)结合缓冲液平衡5个柱體(tǐ)积，然后将样品上柱，上完样后，用(yòng)结合缓冲液平衡。

（4）洗脱优化：螯合金属离子的IMAC琼脂糖凝胶FF最常用(yòng)的洗脱方法為(wèi)增加咪唑浓度进行洗脱。初次实验不知道洗脱的咪唑浓度，可(kě)尝试不同的浓度洗脱，建议在结合缓冲液中分(fēn)别加入5mM、10mM、20mM、50mM、100mM、200mM、500mM咪唑（咪唑為(wèi)碱性物(wù)质，加入咪唑后需重新(xīn)调节pH），浓度从低到高，先后分(fēn)别洗脱和收集，通过SDS-PAGE電(diàn)泳等方法鉴定洗脱组份。

4、再生清洗

（1）多(duō)次使用(yòng)后或需要更换螯合的金属离子，必须将凝胶脱去金属离子再生。脱金属离子方法：用(yòng)5-10个柱體(tǐ)积蒸馏水淋洗柱子，再用(yòng)10个以上柱體(tǐ)积的100 mM EDTA淋洗柱子，再用(yòng)3-5个柱體(tǐ)积的0.5M NaCl洗掉残留的EDTA。

（2）多(duō)次使用(yòng)的柱子脱镍后一般需要清洗。清洗方法：用(yòng)0.1-1.0M NaOH反向清洗柱子，流速50cm/h，保持1-2h，能(néng)去除结合强的杂质，同时也能(néng)去除热源。NaOH清洗后应立即用(yòng)5个柱體(tǐ)积以上的蒸馏水清洗至中性，清洗后可(kě)按照螯合金属离子的方法重新(xīn)螯合金属离子。

5、保存

IMAC琼脂糖凝胶FF和螯合金属离子后的IMAC琼脂糖凝胶FF都可(kě)以用(yòng)20%乙醇保存，一般蒸馏水清洗后，用(yòng)3个柱體(tǐ)积20%乙醇清洗。20%乙醇清洗后的层析柱和凝胶可(kě)放置在2-25℃条件下保存。