制药工具|蛋白纯化常见标签

重组蛋白是应用(yòng)基因重组克隆技术从而获得的蛋白质。基因重组技术先应用(yòng)基因克隆或化學(xué)合成技术获得目的基因，再连接到适合的表达载體(tǐ)，导入到特定的宿主细胞，利用(yòng)宿主细胞的遗传系统，最终表达出具有(yǒu)特定功能(néng)的蛋白质。

重组蛋白表达技术已经广泛应用(yòng)于生物(wù)學(xué)的各个领域，目前，體(tǐ)外重组蛋白表达系统主要有(yǒu)以下几类：原核表达系统、真核表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物(wù)细胞表达系统。一般的实验过程包括载體(tǐ)构建-表达鉴定-蛋白纯化等等。

其中，蛋白纯化的目的是将目标蛋白从实验样本中分(fēn)离出来，同时仍保留目的蛋白的理(lǐ)化特性及生物(wù)學(xué)功能(néng)。在蛋白纯化的过程中，合适的标签不但有(yǒu)利于蛋白的纯化，同时也可(kě)能(néng)对蛋白的可(kě)溶性和稳定性有(yǒu)一定帮助。利用(yòng)基因重组技术，将蛋白标签与目的蛋白一起融合表达并用(yòng)于下一步纯化。目前较為(wèi)常用(yòng)的蛋白标签主要有(yǒu)：His-tag、GST-tag、MBP-tag、Strep-tag II、SUMO-tag、HA-tag等，部分(fēn)功能(néng)和特点如下表所示。

一、His-tag

His-tag由多(duō)个组氨酸残基（一般為(wèi)6个）组成，可(kě)插入在目的蛋白的C末端或N末端，标签本身的特性对目的蛋白影响很(hěn)小(xiǎo)，免疫原性相对较低，纯化的蛋白直接用(yòng)于抗體(tǐ)制备，是目前最常用(yòng)的表达纯化标签。

His-tag可(kě)以与Ni²⁺、Co²⁺等过渡金属离子形成配位键，与金属离子选择性结合，从而可(kě)以将金属离子固定在磁珠或树脂上，对蛋白进行纯化。其中，Ni²⁺是亲和纯化实验中使用(yòng)最多(duō)的金属离子，Ni²⁺在琼脂糖上的螯合形式多(duō)样，不同的螯合结构决定了Ni²⁺在层析介质上的稳定性和结合能(néng)力差异，目前市面上His-tag蛋白纯化介质比较常用(yòng)的配基是IDA、NTA和TED。

使用(yòng)方法简述：

1、平衡和上样：用(yòng)平衡缓冲液平衡层析柱，进行上样。

2、洗杂：在缓冲液中添加低浓度的咪唑（譬如5~50mM）冲洗层析柱。

3、洗脱：用(yòng)合适浓度的咪唑缓冲液进行洗脱（建议用(yòng)50~500mM的線(xiàn)性梯度）。

4、再生：建议选择加有(yǒu)200 mM EDTA+500 mM NaCl的缓冲液将Ni²⁺金属离子剥离。

5、在位清洗（CIP）：通常上述的再生过程可(kě)将填料彻底清洗。

6、填料保存：填料的初始保存液為(wèi)20%乙醇，使用(yòng)过后可(kě)继续用(yòng)20%乙醇保存。保存温度在4~30 ℃為(wèi)宜，不可(kě)冻存。

二、GST-tag

1988年，Smith和Johnson首次提出谷胱甘肽S-转移酶（GST）亲和标签的概念，GST是由多(duō)基因编码、具有(yǒu)多(duō)种功能(néng)的超家族酶，广泛存在于细菌、真菌、动物(wù)和植物(wù)體(tǐ)内，其专一性催化还原型的谷胱甘肽巯基与其他(tā)化合物(wù)的亲電(diàn)基团，生成谷胱甘肽衍生物(wù)。在生物(wù)研究领域，来源于日本血吸虫的GST，是目前应用(yòng)最為(wèi)广泛的融合标签之一。基于酶和底物(wù)的作用(yòng)原理(lǐ)，利用(yòng)谷胱甘肽（GSH）结构和GST结合位点互补的特点，将谷胱甘肽SH基团与琼脂糖介质上的预活化基团偶联，形成特异性的亲和填料。带有(yǒu)GST标签的目标蛋白与琼脂糖介质上交联的GSH配基发生结合。这种结合具有(yǒu)可(kě)逆性，可(kě)以在温和、非变性的条件下通过在缓冲液中加入还原型GSH洗脱下来，杂质在结合过程中流穿或被洗脱去除，实现目的蛋白的分(fēn)离。

GST-tag作為(wèi)标签蛋白应用(yòng)到重组蛋白的纯化过程中，可(kě)插入在目的蛋白的C末端或N末端。一般选择GST-tag可(kě)以提高蛋白表达的可(kě)溶性，也可(kě)以一定程度上提高蛋白的表达量。蛋白表达纯化结束后需根据不同的下游应用(yòng)而确定是否切除标签。GST-tag洗脱条件温和，但跟His-tag相比，分(fēn)子量较大，可(kě)能(néng)会影响蛋白的功能(néng)和下游实验的应用(yòng)。另外，如果蛋白以不可(kě)溶的方式表达出来，很(hěn)难用(yòng)变性复性的方法进行纯化。

使用(yòng)方法简述：

1、平衡和上样：用(yòng)平衡缓冲液平衡层析柱，进行上样。

2、洗脱：用(yòng)合适浓度(建议10 mM)的还原型谷胱甘肽溶液进行洗脱。

3、再生：先用(yòng)蒸馏水冲洗，接着用(yòng)平衡液冲洗至平衡。

4、在位清洗（CIP）：可(kě)用(yòng)盐酸胍也可(kě)用(yòng)70%乙醇清洗。

5、填料保存：填料的初始保存液為(wèi)20%乙醇，使用(yòng)过后可(kě)继续用(yòng)20%乙醇保存。保存温度在4~30 ℃為(wèi)宜，不可(kě)冻存。

三、MBP-tag

MBP即麦芽糖结合蛋白，由大肠杆菌K12的malE基因编码，是细菌麦芽糖转运系统的成员之一，能(néng)结合微摩尔水平的麦芽糖和麦芽糊精。1988年，MBP亲和标签首次应用(yòng)于大肠杆菌重组蛋白的表达纯化，值得一提的是，MBP的折叠过程需要DnaK-DnaJ-GrpE和GroEL-GeoES两个分(fēn)子伴侣系统的帮助，当进行MBP融合蛋白的重组表达时，这些分(fēn)子伴侣也会聚集在目标蛋白的附近，帮助它们正确折叠，并增加目标蛋白的可(kě)溶性。

MBP是蛋白质纯化最常用(yòng)的大标签，分(fēn)子量约42 kD，MBP可(kě)以和糊精亲和树脂结合，可(kě)用(yòng)10-20 mM麦芽糖在温和条件下洗脱，得到高纯度、高浓度目标蛋白，达到快速、高效的捕获与纯化目的。若需要除去MBP-tag，可(kě)用(yòng)位点特异性蛋白酶切除。

使用(yòng)方法简述：

1、平衡和上样：用(yòng)平衡缓冲液平衡层析柱，进行上样。

2、洗脱：一般推荐用(yòng)10mM麦芽糖溶液进行洗脱。

3、再生：先用(yòng)蒸馏水清洗，然后用(yòng)0.5M NaOH再生。

4、填料保存：填料的初始保存液為(wèi)20%乙醇，使用(yòng)过后可(kě)继续用(yòng)20%乙醇保存。保存温度在4~30 ℃為(wèi)宜，不可(kě)冻存。

四、Strep-tag II

Strep-tag是基于生物(wù)素和链霉亲和素之间的相互作用(yòng)而开发出来的。Strep-tag分(fēn)子量较小(xiǎo)，仅有(yǒu)0.8kD，对融合后蛋白质结构和功能(néng)的影响可(kě)以忽略不计，通常无需切除。早期开发的第一代Strep-tag仅可(kě)以接在蛋白的C端，对实际应用(yòng)产生了一定的限制，故而研究者在Strep-tag的基础上，进一步开发了Strep-tag II，可(kě)以结合在蛋白质的N端和C端。不过随着对标签的特异性以及亲和力的要求进一步提升，研究者进一步进行了改造，通过将两个Strep-tag以linker连接在一起，开发出Twin Strep-tag，再度提升了目标蛋白与Strep-Tactin的结合强度，改善了低浓度样本纯化效果，还能(néng)用(yòng)于捕捉蛋白复合體(tǐ)、检测蛋白间的相互作用(yòng)。Strep-tag 具有(yǒu)特异性高、单步纯化纯度高、过程条件温和、蛋白两端均可(kě)融合等特点。

同时相应地，作為(wèi)纯化配基的链霉亲和素，為(wèi)了增强和标签的亲和能(néng)力，以及降低洗脱的难度，研究者也进行了一系列的改造。纽龙生物(wù)研发团队通过分(fēn)子克隆蛋白重组等技术，对链霉亲和素进行改造，开发出Strep-tactin和Strep-tactin2做為(wèi)纯化填料的配基，具有(yǒu)更高的亲和力，可(kě)以按照不同应用(yòng)场景选用(yòng)不同的物(wù)质进行洗脱和再生，满足不同的需求。

使用(yòng)方法简述：

1、平衡和上样：用(yòng)平衡缓冲液平衡层析柱，进行上样。

2、洗脱：用(yòng)合适浓度的缓冲液（脱硫生物(wù)素或生物(wù)素）进行洗脱。

3、再生：用(yòng)0.5M NaOH或者合适浓度的HABA缓冲液再生。

4、填料保存：填料的初始保存液為(wèi)20%乙醇，使用(yòng)过后可(kě)继续用(yòng)20%乙醇保存。保存温度在4~30 ℃為(wèi)宜，不可(kě)冻存。

随着研究需求的增多(duō)和生物(wù)技术的发展，各种标签应运而生，多(duō)样化的标签蛋白可(kě)以满足不同的实验目的，除了本文(wén)提到的标签外，还有(yǒu)Myc、HA、SUMO等，如您有(yǒu)新(xīn)的标签蛋白以及纯化填料需求，纽龙生物(wù)愿以开放的态度，与您携手，共同开发。 

五、纽龙产品介绍

杭州纽龙生物(wù)科(kē)技有(yǒu)限公司是一家专注于重组蛋白以及蛋白纯化填料研发生产的國(guó)家高新(xīn)技术企业。基于自有(yǒu)技术平台，实现填料与配基的双重突破，开发出一系列可(kě)用(yòng)于不同标签蛋白的纯化填料，如Ni-IDA NUPharose FF、GST NUPharose FF、Strep-Tactin NUPharose FF、Dextrin NUPharose FF等，性能(néng)可(kě)比可(kě)靠，批间差小(xiǎo)，供货持续稳定，此外，我们提供不螯合金属离子的纯化填料，可(kě)以满足客户在重组蛋白纯化领域的不同需求，如有(yǒu)需要，欢迎拨打0571-82872376联系我们。

参考文(wén)献：

[1]Pina, Ana & Batalha, Íris & Roque, Ana. (2014). Affinity Tags in Protein Purification and Peptide Enrichment: An Overview. 10.1007/978-1-62703-977-2_14.

[2]Kimple ME, Brill AL, Pasker RL. Overview of affinity tags for protein purification. Curr Protoc Protein Sci. 2013 Sep 24;73:9.9.1-9.9.23. doi: 10.1002/0471140864.ps0909s73. PMID: 24510596; PMCID: PMC4527311.

[3]Mishra V. Affinity Tags for Protein Purification. Curr Protein Pept Sci. 2020;21(8):821-830. doi: 10.2174/1389203721666200606220109. PMID: 32504500.